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荧光定量PCR仪的两大误区你认识吗

发布时间:2021-08-19浏览:56次
  荧光定量PCR仪可标记有荧光素的探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得CT值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
 
  面对各种不同性能的产品,您又该如何选择呢?
 
  首先建议大家走出认识 荧光定量PCR仪的两个误区:
 
  误区一:仪器通道越多越好
 
  随着PCR技术的成熟运用,多重扩增越来越热闹,荧光定量PCR仪也不能幸免。从最初ABI公司推出的单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪仪,眼花缭乱的选择让人无所适从,就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。
 
  在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时,为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料)或专用的Reference dye,这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来,真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的,有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪的有效检测通道尤为重要,不能单单只听宣传。
 
  考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发,多重PCR并非人人适用、人人可用,因为它使实验复杂化了。
 
  误区二:real-time PCR仪无需梯度功能
 
  对于使用染料法的定量PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值),但运用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果,退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出适合的反应条件。
 
  不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要,因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异,优化延伸温度就显得很重要。
 
  使用有梯度功能的荧光定量PCR可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程,简化了摸索PCR反应条件的繁琐实验,既节省实验时间提高效率,又节省实验成本。
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